В16 меланома

Оглавление:

Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы в16 у мышей

Владельцы патента RU 2650587:

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано при воспроизведении агрессивного атипичного роста меланомы B16 у мышей. Способ включает модификацию хронической болью злокачественного роста меланомы. Для этого предварительно, за 2 недели до перевивки опухоли, создают модель хронической боли путем перевязки седалищных нервов с двух сторон. В последующем проводят подкожную имплантацию суспензии опухолевых клеток мышиной меланомы В16 в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл в разведении 1:10. Оценку результатов эксперимента осуществляют через 1-4 недели после перевивки опухоли. Способ обеспечивает изменение патогенеза меланомы В16 у мышей, что приводит к раннему выходу подкожных опухолей, раннему метастазированию, метастазированию в нетипичные места и к ранней гибели животных. Такая экономичная и доступная модель может быть использована для поиска путей медикаментозного лечения злокачественных опухолей с обширным метастазированием. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для модификации злокачественного процесса мышиной меланомы В16 путем создания более агрессивной модели опухолевого роста и метастазирования меланомы в эксперименте.

Хроническая боль является распространенным состоянием, которое оказывает существенное влияние на работоспособность, функциональную активность и качество повседневной жизни и одновременно поводом для огромных расходов на здравоохранение. Она связана с ограничением трудоспособности, снижением качества жизни, финансовой несостоятельностью, семейными проблемами. Столь высокая распространенность острых и хронических болевых синдромов, их тяжелое гуманитарное, социальное и экономическое бремя заставило значительно активизировать за рубежом фундаментальные и клинические исследования, оптимизировать организацию медицинской помощи (созданы специализированные центры и клиники боли), вынести рассмотрение проблемы на правительственный уровень. В результате в медицине сформировалось новое направление — медицина боли. Наряду с этим в нашей стране наблюдается значительное отставание как в активности научных исследований, так и в медицинской помощи больным с различными болевыми синдромами. Несмотря на значительный прогресс в понимании нейрофизиологии и психологии боли, фундаментальные и клинические аспекты проблемы хронической боли остаются во многом нерешенными (см. Яхно Н.Н., Кукушкин М.Л. Хроническая боль: медико-биологические и социально-экономические аспекты. Вестник РАМН. 2012; 9: 54-58).

Так, установлено, что боль вызывает анурию, влияет на работу сердечно-сосудистой системы, ЖКТ, селезенку, железы внутренней секреции и т.д. Длительная хроническая боль перестраивает деятельность всех отделов спинного и головного мозга, ухудшается зрение, притупляется слух и обоняние. Течение биохимических процессов в организме изменяется, одни ферменты усиливают свою активность, другие ослабляют ее. Даже способность лейкоцитов крови захватывать бактерии (фагоцитоз) резко снижается. А это говорит о том, что при боли страдают иммунные свойства организма, т.е. способность его бороться с инфекцией. Согласно исследованиям С.М. Дионесова боль снижает сопротивляемость организма к развитию злокачественных опухолей [Кассиль Т.Н. Наука о боли. (см. Академия Наук СССР. Серия «Проблемы науки и технического прогресса»). 2-е дополненное издание. М.: Наука. 1975. 400 с.).

Боль является одним из самых распространенных симптомов у онкологических больных, с прогрессированием заболевания — ее частота увеличивается. Тип боли и ее интенсивность зависят от местоположения опухоли и стадии болезни. Боль присутствует у 30-50% больных при проведении противоопухолевой терапии и у 65-90% пациентов с прогрессированием онкопроцесса, 33% пациентов страдают от боли после окончания противоракового лечения (см. Foley KM., Van den Beuken-van Everdingen MH и др., 2007, Leppert W и др., 2016). Причины боли у онкологических больных, как правило — многофакторные: прямые и косвенные эффекты рака, побочное действие противоопухолевой терапии, сопутствующие заболевания, а патофизиологические механизмы сочетанные, включая как ноцицептивный (соматический и/или висцеральный), так и нейропатический (неврологический) компоненты (см. Leppert W. и др., 2016).

Эксперимент позволяет дать ответы на многие вопросы, в том числе и в отношении хронической боли при онкологической патологии. Так, путем инокуляции клеток саркомы Meth А в непосредственной близости от седалищного нерва у BALB / с мышей был создан болевой синдром нейропатического генеза: опухоль растет и постепенно сдавливает нерв, тем самым вызывая его повреждение. В данном эксперименте были выявлены термическоая гипералгезия и механическая аллодиния в ипсилатеральной задней лапке на начальном этапе. Дальнейший рост опухоли вызвал понижение механической чувствительности, в то время как тепловая гипералгезия и признаки спонтанной боли по-прежнему сохранялись (см. Shimoyama М., Tanaka К., Hasue F., Shimoyama N. A mouse model of neuropathic cancer pain. Pain. 2002 Sep; 99(1-2): 167-74). У мышей с опухолями костей конечностей было выявлено несколько вариантов изменения периферической чувствительности ноцицепторов. У нормальной мыши нейромедиаторы высвобождались в спинном мозге только в ответ на сильное болевое раздражение. У мыши с костным раком в ответ на обычную безболезненную пальпацию зоны, пораженной опухолью, происходило высвобождение вещества Р в центростремительных волокнах, с последующей активизацией рецепторов нейрокининовой системы особой субпопуляции нейронов спинного мозга, что сопровождалось повышением болевых ощущений (Hunt & Mantyh, 2001; Mantyh et al, 1995a, 1995b).

Аналогичным образом, обычно безболезненная пальпация у мышей с опухолевым поражением конечностей вызывало также появление c-fos протеина в нейронах спинного мозга. У нормальных животных, не имеющих рака, только сильные болевые стимуляторы способны были вызывать появление c-fos протеина в спинном мозге. Таким образом, ноцицепторы под воздействием особых опухолевых алгогенов вовлекаются в процесс генерирования и поддержания костной раковой боли.

Однако ответа на вопрос: участвует ли хроническая боль, в свою очередь, в прогрессировании экспериментальных опухолей и если — да, то каким образом, мы не нашли. Идеальной опухолевой моделью для решения этой задачи является меланома В16, спонтанно возникшая у основания уха мыши линии C57BL/6. Опухоль перевивается в 100% случаев, достаточно быстро растет и при стандартной подкожной перевивке (на 12-16 сутки роста, 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса или среде 199 (1:10)) метастазирует преимущественно гематогенно в легкие (60-90%), реже — в печень и селезенку (см. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. — М.: Медицина, 1980. — 296 с.; Dingemane К.Р. et al. В-16 Melanoma Metastasis in Mouse Liver and Lung I Urn. Metast. — 1985. — №5. — P. 50-60).

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа модификации злокачественного роста меланомы В16 хронической болью у мышей.

Технический результат достигается тем, что предварительно, за 2 недели до перевивки опухоли, создают модель хронической боли путем перевязки седалищных нервов с двух сторон, с последующей подкожной имплантацией суспензии опухолевых клеток мышиной меланомы В16 в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл и в разведении 1:10 и оценкой результатов эксперимента через 1-4 недели после перевивки опухоли.

Изобретение «Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы B16 у мышей» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о модификации роста меланомы В16 у мышей.

Новизна изобретения заключается в предваряющем подкожную перевивку меланомы B16 воссоздании модели хронической боли у мышей, что способствует более ранней гибели животных и развитию патогенеза меланомы B16 по иному «сценарию», чем при стандартном способе перевивки.

Изобретение «Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В16 у мышей» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели злокачественного процесса (меланомы В16) у мышей, протекающего на фоне хронического болевого синдрома, с целью изучения особенностей патогенеза этого процесса и дальнейшей разработки методов его экспериментальной коррекции.

Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В16 у мышей выполняется следующим образом.

Все манипуляции с животными производятся в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицируют общепринятым способом. Каждому животному вводят ксилазолетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вводят ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем — Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела.

После наступления медикаментозного сна ассистент фиксирует мышь в положении на животе, удаляет шерсть сзади в районе проекции седалищных нервов и смазывает кожу 70% спиртом. Экспериментатор в стерильных условиях выделяет седалищный нерв, накладывает на него лигатуру, ушивает рану послойно и обрабатывает шов 5% спиртовым раствором йода. Через 2 недели после заживления операционной раны подкожно вводят 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16 в физиологическом растворе в разведении 1:10. Для этого, соблюдая все условия асептики, описанные выше, ассистент фиксирует мышь спиной кверху, предварительно сбрив шерсть и обработав кожу 5% спиртовым раствором йода чуть ниже правой лопатки. Экспериментатор рукой в стерильной перчатке захватывает кожную складку, в центре которой прокалывает кожу и вводит опухолевую взвесь. Затем извлекает иглу, место введения плотно прижимает ватным тампоном, смоченным в 70% спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание вводимой взвеси. Контролем служили животные с перевивкой меланомы B16 в той же дозе и объеме, что и в основной группе, но без воспроизведения модели хронической боли.

Через 15 дней мыши основной группы (14 штук) начали дохнуть. Средняя продолжительность их жизни составила 19,17±1,35 дней, максимальная — 24 дня. В контрольной группе (11 мышей) — первая смерть наступила на 24 сутки, средняя продолжительность их жизни составила 30,25±1,67 дня, максимальная — 36 дней.

Как видно из представленной таблицы подкожные опухоли появлялись у мышей основной группы уже через 1 неделю после перевивки, у группы сравнения — через 2 недели. Средний объем подкожных опухолей у мышей со временем увеличивался. Однако у группы сравнения подкожная опухоль росла более активно. Так ее средний размер со 2 по 3 неделю увеличился в 3,2 раза, а с 3 по 4 — в 1,7 раза, в то время как у мышей основной группы средний размер опухоли с 1 по 2 неделю увеличился в 2,3 раза, а со 2 по 3 неделю — в 1,5 раза. В результате, у мышей основной группы, средний размер опухоли на 2 неделе эксперимента был в 1,9 раза больше, чем у группы сравнения в это же время, а на 3 неделе — достоверно не отличался от нее. Минимальный размер впервые зафиксированных подкожных опухолей у мышей основной группы (на 1 неделе) был в 2 раза больше, чем у группы сравнения (на 2 неделе), в то время как максимальный размер опухоли на 3 неделе эксперимента у мышей из группы сравнения (без боли) был в 2,5 раза больше, чем у мышей с болью. При этом у большинства мышей с болью 3 неделя — предтерминальный период, а у мышей из группы сравнения — нет.

Несмотря на то, что у мышей с болью объем опухоли нарастал менее активно, у значительного количества мышей на разных этапах исследования, начиная уже с 1 недели, отмечался ее 2-х фокусный рост. Кроме того, поверхностный некроз опухоли появлялся на неделю раньше и у большего количества животных, чем в группе сравнения.

У мышей из основной группы меланома В16 вела себя более агрессивно, поскольку метастазировала чаще, иногда в несколько органов и имела нетипичные для себя зоны метастазирования. Метастазы у мышей с болью регистрировались уже через неделю после перевивки, а у мышей без боли — через 4 недели. У мышей с болью опухоль метастазировала кроме типичных мест: в печень, селезенку и легкие, еще и в нетипичные: сердце, матку.

Ознакомьтесь так же:  Сыпь на ногах и отек

У мышей из основной группы мыши в предтерминальном состоянии регистрировались уже на 1 неделе после перевивки, с развитием процесса их относительное количество увеличивалось. У группы сравнения — с 3 недели.

Технико-экономическая эффективность «Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В16 у мышей» заключается в том, что боль изменяет патогенез меланомы B16 у мышей, приводящей к раннему выходу подкожных опухолей, раннему метастазированию, метастазированию в нетипичные места и приводящей к ранней гибели животных. Разработанный способ может служить моделью для поиска путей медикаментозного лечения злокачественных опухолей с обширным метастазированием. Способ экономичен, доступен.

Способ модификации хронической болью злокачественного роста меланомы В16 у мышей, включающий предварительное, за 2 недели до перевивки опухоли, создание модели хронической боли путем перевязки седалищных нервов с двух сторон, с последующей подкожной имплантацией суспензии опухолевых клеток мышиной меланомы В16 в физиологическом растворе в объеме 0,5 мл и в разведении 1:10 и оценкой результатов эксперимента через 1-4 недели после перевивки опухоли.

Превентивное внутривенное введение зимозан-обработанных нейтрофилов подавляет рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Любимов Геннадий Юрьевич, Любимов Андрей Геннадьевич, Меньщикова Елена Брониславовна, Козлов Владимир Александрович

Исследовалось действие нейтрофилов , активированных ex vivo зимозаном и введенных в хвостовую вену, на рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей. Проведенные эксперименты позволили установить, что внутривенная инъекция обработанных зимозаном нейтрофилов за 3 дня до инокуляции суспензии клеток меланомы B16 приводит к достоверному снижению количества опухолевых узелков в печени (с 33,8 ± 10,9 до 0) и прироста массы пораженной печени (с 612 ± 136 до 0 мг) на 21 день опухолевого роста. Кроме того, произошло достоверное уменьшение количества опухолевых узелков в селезенке (с 4,7 ± 0,6 до 0). Полученные результаты выявили полное подавление роста меланомы В16 в печени и селезенке мышей в результате воздействия активированных ex vivo зимозаном нейтрофилов .

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Любимов Геннадий Юрьевич, Любимов Андрей Геннадьевич, Меньщикова Елена Брониславовна, Козлов Владимир Александрович,

PREVENTIVE INTRAVENOUS INJECTION OF ZYMOSAN-TREATED NEUTROPHILS SUPPRESSES GROWTH OF B16 MELANOMA IN MICE LIVER AND SPLEEN

We investigated the effect of activated ex vivo with zymosan and injected into tail vein neutrophils on the growth of B16 melanoma in mice liver and spleen. Our experiments showed that intravenous injection of zymosan-treated neutrophils 3 days before inoculation of B16 melanoma cell suspension results in a significant decrease of tumor nodule number in the liver (from 33.8 ± 10.9 to 0) and the weight gain of affected liver (from 612 ± 136 to 0 mg). The number of tumor nodules in the spleen dramatically decreased too (from 4.7 ± 0.6 to 0). The results indicate that intravenous injection of zymosan-treated neutrophils leads to a total suppression of B16 melanoma growth in mice liver and spleen.

Текст научной работы на тему «Превентивное внутривенное введение зимозан-обработанных нейтрофилов подавляет рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей»

УДК 612.112.91: 616-006.81

превентивное внутривенное введение зимозан-обработанных нейтрофилов подавляет рост меланомы в16 в печени и селезенке мышей

Геннадий Юрьевич ЛЮБИМОВ1, Андрей Геннадьевич ЛЮБИМОВ1, Елена Брониславовна МЕНЬЩИКОВА2, Владимир Александрович КОЗЛОВ1

1 НИИ фундаментальной и клинической иммунологии 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

2 НИИ экспериментальной и клинической медицины 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Исследовалось действие нейтрофилов, активированных ex vivo зимозаном и введенных в хвостовую вену, на рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей. Проведенные эксперименты позволили установить, что внутривенная инъекция обработанных зимозаном нейтрофилов за 3 дня до инокуляции суспензии клеток меланомы B16 приводит к достоверному снижению количества опухолевых узелков в печени (с 33,8 ± 10,9 до 0) и прироста массы пораженной печени (с 612 ± 136 до 0 мг) на 21 день опухолевого роста. Кроме того, произошло достоверное уменьшение количества опухолевых узелков в селезенке (с 4,7 ± 0,6 до 0). Полученные результаты выявили полное подавление роста меланомы В16 в печени и селезенке мышей в результате воздействия активированных ex vivo зимозаном нейтрофилов.

Ключевые слова: нейтрофилы, макрофаги, зимозан, глюкан, печень, селезенка, меланома.

Активирующее действие зимозана на имму-нокомпетентные клетки более 50 лет находится под пристальным вниманием ученых. Однако микрочастичковая природа зимозана, а также свойство составляющих его молекул глюкана активировать фагоциты и систему комплемента приводит к череде побочных эффектов и тяжелых осложнений [12, 13, 16], что препятствует применению зимозана в медицинской практике. Также известно, что фактически любая микрочастица, попавшая в организм, захватывается фагоцитирующими клетками [2, 6]. В связи с этим возникла идея — изначально, в условиях ex vivo, инкорпорировать частицы зимозана в фагоциты, а затем вводить их в организм животного или человека.

Ранее нами показано, что макрофаги, обработанные зимозаном в условиях in vitro и в последующим введенные в портальную вену, проявляют противоопухолевое действие, подавляя рост меланомы В16 в печени мышей [1]. Если в даль-

нейшем пытаться внедрять этот экспериментальный метод в лечебной практике, то процедура использования макрофагов, получаемых из моноцитов крови человека, окажется дорогостоящей и трудоемкой [5]. В связи с этим целесообразно проведение аналогичной серии экспериментов с использованием нейтрофилов, так как методика их получения менее затратна и, согласно данным некоторых исследователей, наряду с макрофагами нейтрофилы способны принимать участие в противоопухолевой защите организма [8-10, 14]. Кроме того, очевидно, что метод внутрипорталь-ного введения клеток инвазивен и технически сложен, к тому же сама процедура вызывает у пациентов чувство страха и эмоционального дискомфорта.

Вышесказанное определило цель настоящего исследования — изучить эффект внутривенного (через хвостовую вену) введения мышам зимозан-обработанных нейтрофилов на рост меланомы В16.

Любимов Г.Ю. — к.м.н., научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза, e-mail: glubimov@rambler.ru

Любимов А.Г. — младший научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза, e-mail: glubimov@rambler.ru

Меньщикова Е.Б. — д.м.н., зав. лабораторией молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, e-mail: lemen@centercem.ru

Козлов В.А. — д.м.н., проф., академик РАН, зав. лабораторией клинической иммунопатологии, е-mail: niiki01@online.nsk.su

материал и методы

В работе использовали 30 самок мышей (CBA х C57BL/6)F1 в возрасте 6-8 мес., массой 32-38 г, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (г. Новосибирск). Уход за экспериментальными животными и их содержание в условиях вивария были стандартными и соответствовали требованиям приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» № 1045-73 от 06.04.1973, а также № 1179 от 10.10.1983 МЗ СССР, № 267 от 19.06.2003 МЗ РФ, «Правилам по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденным МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципам Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996).

Мыши были разделены на 3 группы: животным группы интактного контроля (n = 5) в хвостовую вену вводили 0,5 мл натрий-фосфатного буфера (PBS), животным группы позитивного контроля (n = 5) — 0,5 мл PBS и клетки меланомы B16, животным группы опыта (n = 5) — нейтро-филы, инкубированные в присутствии зимозана, в 0,5 мл PBS и клетки меланомы B16 (см. ниже). Эксперимент повторяли дважды.

Зимозан (Биохимреактив, Латвия) гомогенизировали тефлоновым пестиком при 2000 об/мин в течение 90 с (допустимый размер гранул 1-5 мкм) и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин в неинактивированной сыворотке мышей. Затем гранулы зимозана трижды отмывали в 10 мл натрий-фосфатного буфера (PBS) при 3000 об/мин.

За 3 часа до выделения нейтрофилов мышам внутрибрюшинно вводили 1 мл 10%-го раствора пептона (Difco, США). Животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации. Для получения клеток в брюшную полость вводили 10 мл холодного PBS, брюшко массировали в течение 60 с, затем шприцем извлекали ранее введенный раствор. Содержание нейтро-филов в полученной таким образом суспензии клеток составляло 98 %, что подтверждено све-тооптическим исследованием приготовленных из нее мазков, окрашенных по Романовскому -Гимзе.

В пластиковом флаконе для культивирования с площадью 25 см2 создавали монослой нейтро-филов плотностью 1 х 106/см2, заливали 10 мл культуральной среды RPMI-1640 c 10 % инакти-вированной сыворотки мышей и 2 мг/мл зимоза-

на. Фагоцитоз проводили в течение 40 мин в термостате при 37 °С.

После фагоцитоза пластиковый флакон трижды отмывали от непоглощенных гранул зимозана 20 мл PBS, монослой клеток открепляли от поверхности флакона резиновым скрепером и доводили до концентрации 30 х 106/мл холодным PBS. Полученную суспензию клеток вводили в хвостовую вену в объеме 0,5 мл (таким образом, количество введенных нейтрофилов составляло 15 х 106 на мышь) за 3 дня до инъекции клеток меланомы В16.

С целью образования печеночных очагов роста опухоли 10 000 клеток меланомы В16 (получены из банка опухолевых линий Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена) вводили в портальную вену. На 21-й день после инъекции опухолевых клеток животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации, проводили эвис-церацию печени и селезенки. Определяли массу печени, селезенки и подсчитывали в них число поверхностно расположенных опухолевых узелков. Массу опухоли определяли как разницу между массой печени животных группы позитивного контроля и группы интактного контроля, группы опыта и группы интактного контроля.

Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m), и представляли в виде M ± m. Различия между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, достоверными считали результаты при р

Свидетельство о регистрации СМИ Эл № ФС77-52970

Влияние ионизирующих излучений и противоопухолевых препаратов на клетки SP линии В16 меланомы и линии MCF-7 аденокарциномы молочной железы Матчук Ольга Николаевна

Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Матчук Ольга Николаевна. Влияние ионизирующих излучений и противоопухолевых препаратов на клетки SP линии В16 меланомы и линии MCF-7 аденокарциномы молочной железы: диссертация . кандидата биологических наук: 03.01.01 / Матчук Ольга Николаевна;[Место защиты: Федеральный медицинский исследовательский центр имени П.А. Герцена].- Обнинск, 2015.- 141 с.

Содержание к диссертации

ГЛАВА 1 Обзор литературы

1.1 Гетерогенность опухолевых клеток in vitro и in vivo, определяемая методом SP 23

1.2 Характерные особенности клеток SP при культивировании в разных условиях и их связь со свойствами опухолевых стволовых клеток 26

1.3 Чувствительность клеток SP к редко- и плотноионизирующему излучению 31

1.4 Химиорезистентность клеток SP 37

1.5 Механизмы радио- и химиорезистентности клеток SP 42

ГЛАВА 2 Материалы и методы

2.1 Культивирование клеток меланомы В16 и рака молочной железы MCF-7 in vitro 52

2.2 Идентификация и определение количества клеток SP в изучаемых культурах с помощью проточной цитофлуориметрии 52

2.3 Сортировка клеток по способности исключать флуоресцентный краситель Но342 56

2-4 Методы сравнительного исследования клеток SP и NSP 57

2 д і Определение клоногенной способности клеток изучаемых популяций з

2.4.2 Анализ клеточного цикла в отсортированных популяциях 58

2.4.3 Определение внутриклеточного содержания оксида азота в изучаемых популяциях опухолевых клеток 59

2.4.4 Исследование экспрессии поверхностных маркеров в клетках SP и NSP аденокарциномы молочной железы линии MCF-7 60

2.4.5 Определение двунитевых повреждений ДНК в клетках изучаемых популяций меланомы линии В16 62

2.4.6 Анализ содержания БТШ27 и БТШ70 в клетках SP и NSP линии MCF-7 63

Облучение клеток, источники ионизирующих излучений 65

Обработка клеточных культур противоопухолевыми препаратами 69

Статистический анализ полученных результатов 70

Количественная оценка и характеристика клеток SP в контроле по экспрессии поверхностных маркеров CD44 и

CD24 в сравнении с остальной массой клеток 71

Изменение количества клеток SP меланомы В16 и рака молочной железы MCF-7 под действием у-излучения в разных дозах 73

Сравнительный анализ чувствительности клеток изучаемых популяций к действию редко- и плотноионизирующего излучений на примере меланомы В16 76

Влияние гамма- и нейтронного излучения на репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии MCF-7 77

Ознакомьтесь так же:  Погонажное изделие грибок

Влияние противоопухолевых препаратов на субпопуляционный состав клеточных культур 79

3.5.1 Изменение количества клеток SP меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы MCF-7 под действием метотрексата 79

3.5.2 Изменение относительного и абсолютного количества клеток SP линии MCF-7 после инкубации с цисплатином и салиномицином 82

Механизмы высокой резистентности клеток SP к действию редкоионизирующего излучения по сравнению с остальной массой клеток 86

3.6.1 Распределение клеток изучаемых популяций по фазам клеточного цикла 86

3.6.2 Сравнительная оценка спонтанных и радиационно-индуцированных двунитевых повреждений ДНК по количеству фокусов уН2АХ в клетках SPHNSP 89

3.6.3 Содержание оксида азота (II) в клетках сравниваемых популяций 91

3.6.4 Конститутивный и радиационно-индуцированный уровень БТШ27 и БТШ70 в изучаемых популяциях клеток 93

ГЛАВА 4 Обсуждение результатов

4.1 Метод SP и возможность идентификации с его помощью фракции, обогащенной опухолевыми стволовыми клетками 96

4.2 Закономерности действия ионизирующего излучения разного качества на клетки SP 97

4.3 Молекулярно-клеточные механизмы резистентности SP и других популяций, экспрессирующих маркеры опухолевых стволовых клеток, к действию редкоионизирующего излучения 100

4-4 Высокая химиорезистентность клеток SP и других популяций, выявляемых по экспрессии маркеров опухолевых

стволовых клеток 104

Список сокращений и условных обозначений 112

Чувствительность клеток SP к редко- и плотноионизирующему излучению

Известно, что любое злокачественное новообразование гетерогенно по клеточному составу и состоит из популяций опухолевых клеток, отличающихся по чувствительности к противоопухолевым воздействиям. Исследование различных проявлений и причин такой гетерогенности, влияющей на эффективность противоопухолевой терапии, представляет значительный интерес для радиационной биологии и онкологии. Существуют разные виды гетерогенности, но в данном разделе работы будут проанализированы некоторые аспекты внутриопухолевой гетерогенности, отражающей тот факт, что каждая отдельная опухоль или культура опухолевых клеток состоит из функционально и фенотипически неоднородных опухолевых клеток [7].

Внутриопухолевая гетерогенность наблюдается на морфологическом, биохимическом, молекулярно-генетическом и других уровнях, тесно связанных между собой [3, 80]. В частности, опухолевые клетки одного и того же новообразования in vivo или клеточной культуры in vitro могут отличаться по способности к обратной транспортировке из цитоплазмы ряда соединений, в том числе липофильного красителя Но342. Поэтому при проточноцитометрическом исследовании можно выявить две популяции опухолевых клеток: слабо окрашенные клетки, которые интенсивно откачивают Но342 и формируют так называемую боковую популяцию (side population — SP), и остальные клетки, которые сильно окрашиваются Но342. В отношении последних в мировой литературе часто применяется термин «поп side population — NSP» (не боковая популяция). В данной работе используются оба термина (SP и NSP), которые являются общепринятыми в мировой литературе.

Существование клеток SP впервые было обнаружено Маргарет Гуделл и соавторами в 1996 г. [66]. Первоначальный замысел исследователей состоял в изучении влияния гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) на восстановление кроветворения в организме летально облученных реципиентов (мышей) в зависимости от пролиферативной активности этих клеток. Клетки предполагалось разделить с помощью флуоресцентного красителя Но342, который применялся как индикатор различных фаз клеточного цикла. Результаты проведенных экспериментов оказались неожиданными. При исследовании костного мозга мышей, инкубированного с красителем Но342, была обнаружена группа клеток, которые слабо окрашивались этим красителем. На графике распределения клеток по интенсивности флуоресценции в двух диапазонах длины волны (450 и 675 нм) эта группа формировала небольшую (-0,1 %), но четко обозначенную популяцию, расположенную в стороне (сбоку) от основной массы клеток. Термин «боковая популяция» (SP) возник из-за расположения таких слабоокрашенных клеток на указанном графике. Существенно, что количество клеток SP многократно уменьшалось после инкубации с верапамилом -известным ингибитором АТФ-связывающих транспортеров. Эта особенность клеток SP используется и по сей день для их выявления с помощью проточной питометр ИИ.

Гуделл и соавторами было показано, что эти клетки обладают свойствами ГСК, а именно: — клетки SP при трансплантации облученным мышам дают начало большинству клеток крови, т.е. являются полипотентными; — клетки SP способны к длительному поддержанию кроветворения, т.е. обладают свойством самообновления; — большинство клеток SP находятся в состоянии покоя (Go / Gi), лишь 1-3 % относятся к S — G2 фазам клеточного цикла; — большинство клеток SP ( 75 %) имеют иммунофенотип Sca-1 lin neg ow, который является маркером стволовых клеток [196], в то время как во всем костном мозге содержание Sca-1 lin neg ow клеток не превышает 1 %.

Таким образом, впервые метод SP стал использоваться для изучения свойств стволовых клеток гемопоэтической ткани млекопитающих. Позднее клетки SP были обнаружены во множестве других нормальных тканей и органов -молочной железе [16, 48], легких [132], скелетных мышцах [139], почках [94], сердце [136], печени [177], головном мозге [103, 195] и коже [114, 229] человека и животных. Как и в костном мозге, в других нормальных тканях клетки SP являются редкими событиями, составляя, например, в молочной железе 0,2-5,0 % по данным разных авторов [180], в легких — менее 1 % [132], в сердце — около 2 % [136], в почках — 0,03-0,1 % [94] и т.д.

Клетки SP с разной частотой (0,01-20 %) [221], а по некоторым данным, до 37 % [83], были обнаружены в первичных культурах опухолевых клеток или ряде опухолей in vivo: нейробластоме [83], меланоме [70, 131, 219, 237], раке легкого [85], раке головы и шеи [190], раке яичника [86, 87, 189], раке простаты [23] и множестве мезенхимальных новообразований [222]. При этом следует отметить, что в ряде случаев (т.е. у части пациентов) клетки SP не удается идентифицировать. Так, например, при нейробластоме SP была выявлена у 15 из 23 пациентов [83], при раке яичника — у 4 из 6 больных [189]. Однако при исследовании 38 образцов меланомы клетки SP были обнаружены во всех случаях, а их доля составила 0,1-2,2 % от общего числа опухолевых клеток [219].

Многочисленные данные литературы свидетельствуют о существовании SP также в стабильных линиях опухолевых клеток in vitro: JF нейробластомы, D54, U87, U251, U373 глиомы [83], WERI-Rb27 ретинобластомы [175], В16 меланомы [49], SAS, SASV03, HSC4, SCC25 рака головы-шеи [31, 186, 223, 227], NPA, WRO, SW1736, С643, HTh74 рака щитовидной железы [62], Н460, Н23, НТВ-58, А549, Н441, Н2170 рака легкого [85], MCF-7, MDA-MB-231 рака молочной железы [82, 158], КМН2, L428 лимфомы Ходжкина [142], RC-58T рака простаты [250], А2780, MOVCAR7 и 4306 рака яичника [50, 189], HeLa, SiHa рака шейки матки [127, 165, 178], ЕС9706 and ЕС109 рака пищевода [89], MKN-45, BGC-823 рака желудка [239] и многих других линиях опухолевых клеток желудочно-кишечного тракта человека [78, 118]. При этом следует отметить, что наличие SP характерно не для всех линий опухолевых клеток, например, эта популяция не обнаружена в клеточных линиях, происходящих из опухоли Вильямса (SK-NEP 26 1), рабдомиосаркомы (А 204) [83], рака яичника (MOVCAR8) [189], рака печени (HepG2) [78], и некоторых других линиях [158]. В отношении остеосаркомы существуют противоречивые данные. Так в работе Yang и соавторов [228], клетки SP были выявлены во всех исследованных операционных образцах первичной остеосаркомы и в то же время не были обнаружены в стабильных линиях остеосаркомы SaOS-2, U20S [83]. Таким образом, существование SP доказано в большинстве изученных объектов (образцах опухолевой ткани, первичных или стабильных линиях опухолевых клеток), включая использованные в данной диссертационной работе.

Определение клоногенной способности клеток изучаемых популяций

Большинство авторов, занимающихся проблемой гетерогенности опухолевых клеток с позиции концепции ОСК, приходят к заключению о более высокой радиорезистентности ОСК по сравнению с остальной массой опухолевых клеток [46, 52, 106, 150, 171, 218]. Следует отметить, что это заключение базируется на многочисленных результатах исследования ОСК, идентифицированных по иммунофенотипу. Данных о радиочувствительности клеток SP и NSP значительно меньше и они носят фрагментарный характер. В первую очередь это связано с малой продолжительностью разработки проблематики, а также с рядом методических трудностей при проведении подобных экспериментов [181], включая подбор оптимальных условий окрашивания и анализа клеток с помощью Но342, которые могут различаться для разных линий опухолевых клеток, необходимость очень точной сортировки клеток SP и NSP, соблюдение строгой стерильности при сортировке в опытах с длительным культивированием этих популяций.

Радиочувствительность SP и NSP изучалась преимущественно в условиях in vitro. Основная часть работ посвящена исследованию эффектов действия редкоионизирующего, главным образом, рентгеновского излучения на указанные популяции. Одним из первых исследований стало изучение в 2007 г. чувствительности клеток SP и NSP культуры рака носоглотки линии CNE-2 к действию рентгеновского излучения в дозе 2,0 Гр [205]. Для оценки репродуктивной гибели был использован классический тест на колониеобразование (подсчет колоний из 50 и более клеток производился через 7 суток после воздействия). Было выявлено, что клетки SP формируют примерно в 4 раза больше колоний после облучения, чем клетки NSP; эта разница была статистически значима. Интересным также представляется то, что для SP не было обнаружено различий по числу колоний до и после облучения, в то время как в случае NSP число колоний после облучения существенно уменьшалось. Эта информация свидетельствует о высокой радиорезистентности SP указанной линии опухолевых клеток по сравнению с NSP; резистентность клеток SP была так высока, что после облучения в стандартной терапевтической дозе гибель клеток отсутствовала. Для определения максимально эффективной дозы, согласно этим данным, необходимо изучение радиочувствительности клеток в широком диапазоне доз, однако, как будет изложено далее, подобных исследований довольно мало.

Приблизительно в то же время были опубликованы первые данные о чувствительности SP и NSP культуры рака молочной железы MCF-7 к действию редкоионизирующего излучения [217]. Авторы работы, как и большая часть исследователей в последующем, для оценки радиочувствительности использовали не классический тест на колониеобразование, а измерение процента SP в общей популяции через сутки и более после облучения. Такой метод дает достаточно информации об относительной радиочувствительности SP и NSP, но имеет некоторые недостатки, например, не позволяет сделать вывод о причине увеличения доли клеток SP после облучения, которая может изменяться как благодаря большей гибели клеток NSP в ранние сроки после воздействия, так и благодаря усиленной пролиферации клеток SP в последующее время. Кроме того, нельзя исключить также возможность перехода клеток NSP в SP вследствие дедифференцировки, которая происходит достаточно редко в интактных культурах, но может усиливаться под влиянием различных факторов как показано в отношении ОСК, выявляемых методом иммунофенотипирования [29, 47, 90, 120]. Группой исследователей во главе с Woodward в 2007 году было показано, что клетки линии MCF-7 в целом являются достаточно радиочувствительными, и статистически значимое увеличение доли клеток SP наблюдается уже при воздействии в дозе 2,0 Гр [217]. Максимальное значение этого показателя наблюдалось при облучении в дозе 4,0 Гр (процент клеток SP увеличивался приблизительно в 5,5 раз по сравнению с контролем), после чего происходило его уменьшение.

Другой подход к сравнительному исследованию радиочувствительности клеток SP и NSP представлен в работе [203]. Авторы облучали в дозе 2,0 Гр отсортированные клетки SP и NSP линии Нер-2 рака гортани и через 2 суток после радиационного воздействия оценивали количество живых клеток. Подавление количества клеток SP под действием радиации составило всего 6,7 %, в то время как количество клеток NSP уменьшалось на 29,9 % (р 0,0001), что позволило авторам сделать вывод о более высокой радиорезистентности первых.

Изучение относительной радиочувствительности клеток SP в различных модельных системах и с помощью различных методов продолжается довольно успешно и сегодня [ПО]. Хотя большинство авторов отмечают меньшую чувствительность клеток SP (чем NSP) к действию редкоионизирующего излучения, в ряде клеточных линий не удается обнаружить это различие. Так, например, в работе Wilson и соавторов в 2013 г. была изучена выживаемость клеток SP и NSP пяти линий рака орофарингеальной зоны с применением классического метода оценки колониеобразования в контроле и после воздействия рентгеновским излучением в дозах до 4,0 Гр [212]. В данном случае объектом исследования служили клетки из ранних пассажей первичных культур, полученных из образцов опухолей до лечения или рецидивных очагов. Ни в одной из изученных клеточных линий авторы не обнаружили значимых различий между клетками SP и NSP по клоногенной выживаемости после облучения. В качестве следующего примера можно привести исследование радиочувствительности 4-х клеточных культур рака поджелудочной железы, только часть из которых продемонстрировала различия в радиочувствительности между SP и NSP к действию редкоионизирующего излучения в однократной дозе 4,0 Гр [96]. Противоречивость полученных результатов может быть объяснена как действительным отсутствием различий радиочувствительности SP и NSP в некоторых клеточных культурах, так и недостаточно широким диапазоном выбранных доз.

Ознакомьтесь так же:  Красные бляшки с сыпью

Влияние гамма- и нейтронного излучения на репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии MCF-7

Исследовали клоногенную способность клеток изучаемых линий в контроле и после облучения. В частности: — сравнивали клоногенную способность (репродуктивную выживаемость) клеток SP и NSP линии В16 после действия редкоионизирующего излучения в разных дозах по параметрам дозовой зависимости D0 и Dq; — сравнивали репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP линии В16 после действия плотноионизирующего излучения в разных дозах (по величине Do соответствующих дозовых зависимостей); — сравнивали репродуктивную выживаемость клеток SP и NSP двух изучаемых линий после действия плотноионизирующего излучения (по величине Do соответствующих дозовых зависимостей).

Как описано в разделе 2.5, отсортированные клетки SP и NSP подвергали радиационному воздействию в разных дозах. После облучения клетки линии В16 культивировали в стандартных условиях в течение 9 суток, клетки линии MCF-7 — в течение 12 суток. Затем фиксировали колонии в 96 % этаноле в течение 15 мин и окрашивали трипановым синим, после чего производили подсчет колоний численностью не менее 40 клеток под инвертированным микроскопом Leica DM IL Led (Leica Microsystems GmbH, Германия). В каждом эксперименте использовали по 4-6 чашек Петри в контроле и по 3-4 чашки Петри на каждую дозу облучения. Построение кривых доза-эффект осуществляли с помощью программы «Origin 6.0» (Microcal Software, Inc., CIIIA) в полулогарифмическом масштабе, принимая количество выросших колоний в контроле в каждой из популяций за 1. На линейном участке дозовых зависимостей вычисляли величину Do с помощью указанной программы. 2.4.2 Анализ клеточного цикла в отсортированных популяциях

Сортировку клеток SP и NSP выполняли до радиационного воздействия или обработки противоопухолевыми химиопрепаратами. Для сортировки клеток указанных популяций использовали культуры линий В16 и MCF-7 в логарифмической стадии роста. С каждой из изучаемых линий клеток проведено не менее 3-х независимых экспериментов.

К отсортированным образцам (количество клеток в каждом не менее 5×10 ) приливали холодный (+4 С) 0,01 М фосфатный буферный раствор с добавлением 0,9 % NaCl, рН 7,2 (phosphate buffered saline — PBS), доводя концентрацию клеток до (1-2)х10 кл/мл. Затем медленно, при постоянном помешивании, в полученную суспензию клеток вливали холодный 96 % этанол в объёмном соотношении 2:1 (этанол : суспензия клеток в PBS). Зафиксированные клетки хранили при +4 С и анализировали в течение 2 мес.

Фиксированные клетки собирали центрифугированием при 200g в течение 15 мин. К осадку добавляли 150 мкл окрашивающего раствора (PBS с добавлением PI до конечной концентрации 0,1 мг/мл, 0,1 % Тритона-ХЮО и 3,9 % ЭДТА) и 150 мкл раствора РНКазы (2 мг/мл, Gibco, США) в PBS в соотношении 1:1. Получившуюся смесь инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего фильтровали через 40-мкм нейлоновый фильтр и немедленно анализировали.

Для анализа окрашенных образцов использовали проточный цитофлуориметр FACS Calibur (BDIS, США), с помощью которого определяли интенсивность прямого и бокового светорассеяния клеток, а также характеризовали флуоресценцию PI по критериям продолжительности (ширины) сигнала и интегральной интенсивности (зоны) сигнала, отражающей содержание ДНК. Для возбуждения флуоресценции PI использовали лазер с длиной волны 488 нм, для регистрации флуоресценции — стандартный фильтр, входящий в базовую комплектацию (585±42нм). Данные записывали в файл, для обработки которого использовали стандартный алгоритм, рекомендованный производителем прибора для выявления клеток в разных фазах клеточного цикла. С помощью программы ModFit 3.1 (BDIS, США) выделяли регион клеток по интенсивности прямого и бокового светорассеяния, затем из анализа исключали дебрис и конгломераты клеток по критерию продолжительности сигнала флуоресценции. Далее строили гистограммы распределения выделенных одиночных клеток по интегральной интенсивности флуоресценции PI и определяли распределение клеток по фазам клеточного цикла.

Определение внутриклеточного содержания оксида азота в изучаемых популяциях опухолевых клеток Внутриклеточное содержание N0 исследовали в клетках SP и NSP изучаемых линий до радиационного или химического воздействий.

Для определения внутриклеточного содержания N0 использован метод, предложенный в 1998 г. Kojima и соавторами [107]. Метод основан на применении 4,5-диаминофлуоресцеин-2-диацетата (ДАФ-ДА), легко проникающего через плазматическую мембрану, а затем подвергающегося в клетке воздействию эстераз. Продукт этой реакции теряет способность проникать через плазмалемму, поэтому остается в клетке и взаимодействует с N0. В результате этой реакции в присутствии кислорода образуется диаминофлуоресцеин-триазол (ДАФ-ТР), который обладает флуоресценцией с высоким квантовым выходом в диапазоне 500-520 нм при возбуждении светом с длиной волны 488 нм. С помощью проточной цитометрии в указанном диапазоне длин волн измеряют интенсивность флуоресценции каждой клетки, которая пропорциональна содержанию N0 при концентрации последнего более 2-5 нмоль/л [144].

Клетки снимали с подложки, считали их концентрацию в камере Горяева и готовили аликвоты по 5×10 клеток. Затем образцы центрифугировали 5 мин при 200g, к осадку добавляли 0,5 мл среды DMEM без сыворотки, 1 мкл ДАФ-ДА (5 мМ в DMSO, Sigma-Aldrich, США) и краситель Но342 в конечной концентрации 5 мкг/мл. Для контроля флуоресценции ДАФ-ТР к части клеток добавляли нитропруссид натрия, являющийся донором N0, в конечной концентрации 10 мМ. К части проб за 15 мин до внесения ДАФ-ДА и Но342 добавляли верапамил до конечной концентрации 25,0 или 12,5 мкг/мл для контроля определения SP в культурах В 16 и MCF-7, соответственно. Все указанные препараты инкубировали с клетками в течение 60 мин при 37 С и периодическом перемешивании. Для исключения из анализа мертвых и погибающих клеток добавляли PI в конечной концентрации 2 мкг/мл. Каждый образец фильтровали с помощью нейлонового фильтра с диаметром пор 40 мкм. Клетки хранили при температуре +4 С не более 30 мин и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACS Vantage. Флуоресценцию Но342 измеряли в красной (675 ± 20 нм) и синей (424 ±20 нм) областях спектра, возбуждая светом 364 нм, как описано ранее. Флуоресценцию ДАФ-ТР регистрировали при длине волны 525 ± 30 нм, возбуждая лазером с длиной волны 488 нм. В каждой пробе анализировали не менее 200 тыс. клеток. Полученные данные обрабатывали с помощью программы CellQuestPro: выделяли регионы клеток SP и NSP, как описано выше, и анализировали интенсивность флуоресценции ДАФ-ТР, по которой судили о внутриклеточном содержании NO в выделенных клетках.

Молекулярно-клеточные механизмы резистентности SP и других популяций, экспрессирующих маркеры опухолевых стволовых клеток, к действию редкоионизирующего излучения

Результаты определения доли клеток SP в интактных культурах линий В16 и MCF-7 подтверждают данные литературы [49, 191]. При этом следует отметить довольно сильное расхождение данных разных авторов по поводу размера этой популяции в интактной культуре линии MCF-7. Так, например, в работе Tanaka и соавторов [191] доля клеток SP составляла в среднем 1,8 %, как и в нашем исследовании, в работе Gong и соавторов — 0,1 % [65], в работе Achuthan и соавторов — около 1 % [9], в работе Zhang и соавторов — 3,6 % [245]. Вероятные причины столь высокой вариабельности данных разных авторов по этому вопросу могут быть связаны как с особенностями культивирования этих клеток в разных лабораториях или использованием разных подлиний этой культуры, так и с отсутствием стандартизированного протокола идентификации SP. В частности, Цынкаловский и соавторы отмечают высокую чувствительность метода SP к условиям его выполнения [6]. Поскольку выведение Но342 представляет собой динамичный процесс, даже небольшие изменения концентрации клеток или красителя, времени или температуры инкубации клеток могут приводить к изменению формирования SP. Однако соблюдение условий окрашивания, тщательное предварительное тестирование метода на надежной системе и выполнение необходимого контроля (с верапамилом, резерпином или другими ингибиторами АТФ-связывающих транспортеров) помогают стабильно получать воспроизводимые результаты.

На примере линии MCF-7 установлена статистически значимая ассоциация SP с иммунофенотипом ОСК молочной железы (CD44 CD24″). В то же время следует отметить, что только часть клеток SP имела этот иммунофенотип, что свидетельствует о гетерогенности изучаемой популяции по экспрессии поверхностных маркеров. Как известно, в последние годы предпринимались многочисленные попытки выделить популяцию ОСК молочной железы по различным критериям, включая высокую экспрессию CD133, CD29, высокую активность ALDH1, низкую экспрессию ряда микро РНК (miR-200c, miR-200b-200а, miR-183-96-182) и т.д. в дополнение к CD44, CD24 [92, 128]. Полученные авторами результаты указывают на гетерогенность популяции ОСК по экспрессии этих маркеров. Причем эта закономерность была характерна не только для рака молочной железы, но и злокачественных опухолей других локализаций [124, 151]. В отношении иммунофенотипической характеристики клеток SP линии MCF-7 данных значительно меньше, и они согласуются с нашими результатами [9,191,245].

Таким образом, иммунофенотипические маркеры ОСК линии MCF-7 экспрессируются чаще в клетках SP, чем в NSP. Кроме того, по данным литературы о свойствах SP обеих линий, использованных в данной работе, эта популяция обладает высокой туморогенной активностью in vivo, высокой клоногенной активностью in vitro, способностью формировать сфероиды при культивировании в соответствующих условиях, способностью восстанавливать гетерогенность исходной опухоли или клеточной культуры (в отличие от NSP) [49, 158, 226, 232]. В целом, данные литературы свидетельствуют о том, что SP представляет фракцию клеток, обогащенную ОСК, и результаты данной работы подтверждают это положение.

Исследования радиочувствительности SP в большинстве изученных линий опухолевых клеток, включая линию MCF-7 рака молочной железы, указывают на более высокую резистентность этой популяции к действию редкоионизирующего излучения по сравнению с остальными клетками [173, 203, 205, 217, 224]. Следует отметить, что в указанных работах эффект облучения регистрировали в основном по увеличению доли клеток SP в разные и , главным образом, ранние сроки после воздействия, что является лишь косвенным доказательством относительно высокой радиорезистентности этих клеток, поскольку не учитывает изменения их клоногенной способности. В нашей работе получены прямые доказательства относительно высокой резистентности клеток SP к действию у-излучения в классических радиобиологических экспериментах по определению DO в отсортированных популяциях меланомы линии В16. В доступной нам литературе отсутствуют данные о радиочувствительности клеток SP и NSP линии В16, судя по результатам поиска в базе биомедицинских публикаций Pubmed NCBI (США). При этом детальное изучение именно этой культуры опухолевых клеток представляет значительный интерес, поскольку она рекомендована в качестве обязательной модельной системы при проведении доклинических исследований противоопухолевых препаратов [5]. Возможность проспективного выделения радио- и химиорезистентной фракции меланомы В16 методом SP, как впервые установлено в данной диссертационной работе, составляет основу нового подхода к тестированию соединений с предполагаемой противоопухолевой активностью по реакции не только общей опухолевой массы, но и отдельно её резистентной части. Можно ожидать, что это повысит эффективность поиска и разработки новых противоопухолевых препаратов. В отношении линии MCF-7 получены данные о более высокой клоногенной способности SP после у-облучения в дозе 2,0 Гр (по сравнению с клетками NSP), что подтверждает цитированные выше данные литературы.

Показанное нами увеличение относительного количества клеток SP в ранние сроки после действия у-излучения на цельные (не фракционированные) культуры изучаемых линий также свидетельствуют об относительно высокой радиорезистентности этой популяции по сравнению с остальной массой опухолевых клеток, что также подтверждает результаты других авторов. Отдельный интерес представляют данные об увеличении абсолютного количества клеток SP после у-облучения в тех же экспериментальных условиях по сравнению с необлученным контролем. При этом, как и следовало ожидать, наблюдалось многократное уменьшение абсолютного количества клеток NSP. Увеличение абсолютного количества клеток SP через 48-72 ч после у-облучения свидетельствует не только о сохранении жизнеспособности облученных клеток SP, но и, возможном повышении их пролиферативной активности после радиационного воздействия, а также о возможном переходе части сохранившихся клеток NSP в пул SP, например, вследствие эпителиально-мезенхимальной трансзиции (ЭМТ) — процесса, который усиливается под действием ионизирующего излучения и является одним из механизмов поддержания клеток в стволовом состоянии, как показывают результаты последних исследований [28, 43, 146, 185]. Точный вклад этих процессов в зарегистрированное нами увеличение абсолютного количества клеток SP требует дальнейших исследований.